MicroRNA-26a在肝细胞癌中功能和机制的研究
【摘要】肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)是世界上最常见、恶性程度最高的肿瘤之一。HCC总体预后目前仍然很差,一个主要原因是术后高的转移复发。血管生成被证实与HCC的侵袭转移密切相关。因此,深入探索HCC转移和血管生成的分子机理及其关键调控环节,对于改善HCC患者预后和为HCC治疗提供新的靶点具有十分重要的意义。微小RNA(microRNA,miRNA)是一些长度约为22nt的非编码调控RNA家族,通过与靶基因3’端非编码区域(3’-UTR)互补配对在转录后水平上对靶基因的表达进行负调控,导致靶基因mRNA的降解或翻译抑制,从而参与发育、增殖、分化、凋亡多种生物学过程。同时miRNAs的异常表达也参与了一些肿瘤的发生和发展。许多的研究证实：某些miRNAs在HCC发生、细胞增殖和凋亡、肿瘤血管生成、侵袭和转移等方面发挥着重要的作用。因此,miRNA可能作为HCC转移新的预测指标和治疗靶点。近年发现miR-26a在多种不同肿瘤中扮演抑癌和促癌的双重角色,其真正原因目前仍然不清楚。我研究所先前研究证实miR-26a低表达的HCC患者有更短生存期但是对干扰素有更好的治疗效果,miR-26a高表达的患者则相反。然而,miR-26a在HCC中潜在的分子机制目前仍然不清,在本研究中,我们探寻miR-26a对HCC患者的预测价值以及其在HCC发生和发展中的功能,进一步阐明miR-26a抑制HCC转移和血管发生的潜在机制。第一部分miR-26a在肝细胞癌中表达水平及其对HCC预后的影响目的：本研究通过检测HCC组织、HCC患者血浆和HCC细胞株中miR-26a表达水平,评估miR-26a与HCC转移复发的关系及其对HCC预后的影响。方法：利用Taqman探针通过实时定量PCR检测130例HCC组织(包括40例配对癌旁组织)和62例HCC患者血浆以及HCC细胞株miR-26a的表达水平,分析miR-26a在HCC组织和对应癌旁组织,复发与无复发HCC组织,转移与无转移的HCC组织和不同转移潜能细胞株中表达情况。Kaplan-Meier法绘制HCC组织和血浆miR-26a总生存曲线(OS)和至复发时间(TTR)曲线,以log-rank法进行组间比较。采用Cox比例风险模型进行单因素和多因素生存分析,确定miR-26a表达水平是否为HCC预后的独立预测指标。结果：(1)HCC组织miR-26a水平与HCC的转移复发呈负相关：HCC组织miR-26a表达水平显著低于其相对应的癌旁组织(P<0.01)；伴转移HCC组织miR-26a表达水平明显低于无转移HCC组织(P<0.01)；有复发HCC组织miR-26a表达水平显著低于无复发HCC组织(P<0.01)。(2)血浆miR-26a水平与HCC的转移和复发呈负相关：伴转移HCC血浆miR-26a表达水平与无转移血浆相比明显降低(P<0.01)；复发HCC血浆miR-26a表达水平显著低于无复发HCC血浆(P<0.01)。(3)HCC细胞株miR-26a的水平与其转移潜能呈负相关：miR-26a在HCC细胞株较正常肝细胞株表达显著下调(P<0.01),高转移潜能组HCC细胞株miR-26a表达水平显著低于低转移潜能组(P<0.01)。(4)HCC组织或血浆miR-26a高表达组患者较HCC组织或血浆miR-26a低表达HCC患者显示了更长的生存时间和更长至复发时间(P<0.01)。单因素和多因素分析提示miR-26a是HCC预后一个独立预测指标。结论：miR-26a在HCC中表达下调,与HCC的转移和复发呈负相关,是HCC预后的一个独立预测指标。第二部分miR-26a通过定向抑制IL-6-stat3信号通路抑制肝细胞癌的生长和转移目的：本研究通过对miR-26a体外和体内功能试验的研究进一步验证并阐述miR-26a参与调控HCC侵袭转移恶性表型的相关分子机理。方法：利用体外增殖、划痕和侵袭试验,周期和凋亡测定及裸鼠体内实验验证miR-26a在HCC细胞中的功能。为了进一步研究miR-26a促进HCC转移的分子机制,我们通过双荧光报告系统分析寻找miR-26a下游靶基因IL-6,并进一步通过Western-blot验证分析miR-26a通过抑制下游IL-6-stat3通路及其下游靶基因发挥抑制HCC生长和转移的作用。采用Cox比例风险模型进行单因素和多因素生存分析,确定miR-26a,IL-6以及miR-26a和IL-6联合是否作为HCC预后的独立预测指标。结果：(1)miR-26a过表达抑制体外HCC细胞增殖和侵袭,诱导细胞周期阻滞,促进细胞凋亡。miR-26a下调抑制细胞凋亡,促进增殖和侵袭,促进细胞G1期进入S期。miR-26a过表达抑制体内HCC生长和转移。(2)IL-6是miR-26a调节HCC细胞生长和转移的功能靶分子。HCC组织miR-26a水平与IL-6mRNA和蛋白水平都呈明显负相关；miR-26a上调显著降低了HCC细胞IL-6表达水平；相反,miR-26a下调却明显增加IL-6表达水平；miR-26a过表达降低了含野生型IL-63’-UTR荧光素酶报告基因活性,而不影响含突变的IL-63’-UTR荧光素酶报告基因活性。伴随着IL-6水平的变化改变miR-26a对HCC细胞增殖,凋亡和侵袭的影响。加入IL-6减弱miR-26a对HCC细胞的作用,而干扰IL-6却产生了miR-26a对HCC细胞的相似影响。(3)miR-26a通过抑制IL-6-stat3信号通路来发挥作用。IL-6-stat3信号通路下游一些靶基因包括Bcl-2,Mcl-1,cyclinD1和MMP2,miR-26a过表达在体内和体外下调p-stat3,Bcl-2,Mcl-1,cyclinD1和MMP2的表达,但加入IL-6却却明显上调了这些蛋白的表达,而shIL-6使p-stat3,Bcl-2,Mcl-1,cyclinD1和MMP2表达明显下调,与miR-26a产生效应相似。(4)HCC组织miR-26a高表达组患者较miR-26a低表达组,HCC组织IL-6低表达组患者较IL-6高表达组,和miR-26a高表达IL-6低表达组较miR-26a低表达IL-6高表达组显示了更长的生存时间和更长至复发时间(P<0.01)。miR-26a,IL-6,miR-26a和IL-6联合均是HCC患者OS和TTR独立的预后指标。miR-26a和IL-6联合对HCC预后的预测效果最好,优于miR-26a或IL-6单个预测。结论：miR-26a可以抑制体外和体内HCC的生长,侵袭和转移。机制上,miR-26a通过抑制IL-6-stat3信号通路介导发挥对HCC的抑制作用。第三部分miR-26a通过定向抑制HGF-cMet信号通路抑制肝细胞癌血管生成目的：通过miR-26a体外和体内对HCC细胞VEGF表达和内皮细胞增殖、迁移和成管研究的基础上进一步验证并阐述miR-26a调控HCC血管生成相关分子机理。方法：利用PCR和免疫组化检测120例HCC患者组织miR-26a,VEGF和MVD水平,分析miR-26a水平和VEGF水平,miR-26a水平和MVD水平的相关性,确认miR-26a与肿瘤血管生成的关系。通过慢病毒介导的miR-26a过表达和干扰载体,构建稳定传代的细胞株,并通过检测HCC细胞VEGF水平和内皮细胞增殖、迁移和成管试验及裸鼠体内实验进一步验证miR-26a在HCC细胞肿瘤血管生成的功能。为进一步研究抑制HCC细胞肿瘤血管生成的分子机制,我们利用双荧光报告系统分析和寻找调节HCC肿瘤血管生成的miR-26a下游靶基因HGF,并进一步通过Western-blot分析miR-26a通过抑制HGF-cMet信号通路及其下游的一些通路发挥抑制血管发生的作用。采用Cox比例风险模型进行单因素和多因素生存分析,确定miR-26a,HGF,VEGF,MVD表达水平以及miR-26a和HGF联合是否作为HCC预后的独立预测指标。结果：(1)HCC组织miR-26a水平与VEGF水平或MVD水平均呈负相关：miR-26a高表达组HCC组织VEGF和MVD表达水平明显低于miR-26a低表达组(P<0.01)。Spearman相关性分析显示HCC组织miR-26a表达水平与VEGF或MVD表达水平都呈显著负相关(P<0.001)。(2)miR-26a上调后显著抑制HCCLM3和MHCC97H上清液中VEGF的表达(P<0.01),同时也抑制了HUVEC的增殖、迁移和成管；而miR-26a下调则促进HCC细胞上清液VEGF表达的上调(P<0.01)；同时也促进HUVEC的增殖、迁移和成管。同时miR-26a过表达组瘤体和血清VEGF蛋白表达水平较对照组也明显降低(P<0.01),miR-26a过表达组瘤体MVD水平较对照明显减少(P<0.01)。(3)HGF是miR-26a下游影响HUVEC增殖、迁移和成管及HCC细胞VEGF表达功能调节者。HCC组织miR-26a水平与HGF蛋白水平呈明显负相关；miR-26a上调显著降低了HCC细胞HGF表达水平：相反,miR-26a下调却明显增加HGF表达水平；miR-26a过表达降低了含野生型HGF3’-UTR荧光素酶报告基因活性,而不影响含突变的HGF3’-UTR荧光素酶报告基因活性。伴随着HGF水平的变化改变miR-26a对HUVEC增殖、迁移和成管及HCC细胞VEGF表达功能调节的影响。加入HGF减弱miR-26a对HUVEC增殖、迁移和成管及HCC细胞VEGF表达功能调节的影响,而干扰HGF却产生与miR-26a相似影响。(4)miR-26a过表达抑制HGF-cMet信号通路及其下游PI3K/Akt/mTOR/S6K信号通路和HIF-1α-VEGF信号通路下调VEGF的表达,并最终抑制了内皮细胞VEGFR2信号通路。加入HGF减弱对抗了这种效应,而干扰HGF却产生与miR-26a相似影响。(5)HCC组织miR-26a高表达组患者较miR-26a低表达组,HGF低表达组患者较HGF高表达组,VEGF低表达组患者较VEGF高表达组,MVD低表达组患者较MVD高表达组,miR-26a高表达HGF低表达组较miR-26a低表达HGF高表达组均显示了更长的生存时间和更长至复发时间(P<0.001)。miR-26a,HGF,VEGF,MVD,miR-26a和HGF联合都是HCC患者OS和TTR独立的预后指标。MVD对HCC预后的预测效能最高,而miR-26a与HGF联合次之,但优于miR-26a或HGF单个预测。结论：miR-26a表达水平与VEGF或MVD表达水平呈明显负相关；miR-26a能显著抑制HCC细胞VEGF的表达和内皮细胞增殖、迁移和成管。机制上,miR-26a通过定向抑制HGF-cMet信号通路抑制HCC血管生成。第四部分干扰素-α1b和5-FU联合治疗性上调miR-26a部分依赖线粒体途径诱导HCC细胞的凋亡目的：通过研究miR-26a对HCC组织和体外与体内HCC细胞中凋亡的影响探寻miR-26a上调诱导HCC细胞凋亡的相关机制以及干扰素-α1b和5-FU联合治疗诱导HCC凋亡的潜在机制。方法：检测58例HCC患者癌组织miR-26a的表达水平,HCC细胞的凋亡和凋亡通路相关蛋白的表达,分析miR-26a与HCC细胞凋亡及凋亡通路相关蛋白的相关性。然后通过体外实验验证miR-26a上调对HCC细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响；检测线粒体膜电位的损失和细胞色素C的释放验证miR-26a是否通过线粒体凋亡途径诱导HCC凋亡。检测体外和体内试验IFN-alb和5-FU联合干预对HCC细胞miR-26a的表达水平,细胞的凋亡,凋亡通路相关蛋白的表达以及线粒体膜电位的损失和细胞色素C的释放,进一步验证IFN-alb和5-FU联合干预诱导HCC细胞凋亡的相关机制是否通过上调miR-26a。结果：(1)miR-26a表达水平与HCC细胞凋亡显著正相关：miR-26a高表达组HCC组织凋亡细胞明显多于miR-26a低表达组(P<0.01)；Spearman相关性分析显示miR-26a表达水平与HCC组织中肿瘤细胞凋亡显著正相关(r=0.5479,P<0.001)；抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表达水平在miR-26a高表达组较miR-26a低表达组明显降低(P<0.01)；而促凋亡蛋白Bax则明显增多,cleavedcaspase3和cleavedcaspase9也明显升高(P<0.01)。HCC组织miR-26a表达水平与Bcl-2或Bcl-xL的蛋白表达水平显著负相关(r=-0.6259,P<0.001;r=-0.7452,P<0.001),而与Bax蛋白,cleavedcaspase3或cleavedcaspase9表达水平呈正相关(r=0.5778,P<0.001;r=0.5398,/><0.001;r=0.4663,P<0.001).(2)miR-26a上调在体外部分通过线粒体途径促进HCC细胞凋亡。miR-26a上调后,凋亡的HCC细胞明显增加,Bcl-2和Bcl-xL的表达减少,Bax,caspase3和caspase9的表达水平增多；同时,miR-26a增加线粒体膜电位的损失,促进细胞色素C从线粒体释放到细胞质。(3)5-FU和IFN-α1b联合干预诱导HCC细胞miR-26a表达上调。体外和体内实验证实IFN-α1b和5-FU联合治疗性上调miR-26a部分通过线粒体凋亡途径诱导HCC细胞的凋亡,而且miR-26a也增加了IFN-α1b和5-FU联合干预诱导HCC细胞凋亡的敏感性。结论：联合IFN-α1b和5-FU治疗性上调miR-26a部分通过线粒体凋亡途径诱导HCC细胞凋亡,同时miR-26a也增加了IFN-α1b和5-FU联合诱导HCC细胞凋亡的敏感性。全文结论1.miR-26a在HCC中表达下调,与HCC转移和复发呈负相关,是HCC患者预后的一个独立预测指标。2.miR-26a可以抑制体外和体内HCC的生长,侵袭和转移。机制上,miR-26a通过抑制IL-6-stat3信号通路发挥对HCC的抑制作用。3.miR-26a的表达水平与VEGF或MVD表达水平呈显著负相关；miR-26a能显著抑制HCC细胞VEGF的表达和内皮细胞增殖、迁移和成管。机制上,miR-26a通过定向抑制HGF-cMet信号通路抑制HCC血管生成。4.联合IFN-α1b和5-FU治疗性上调miR-26a部分通过线粒体凋亡途径诱导HCC细胞凋亡,同时miR-26a也增加了IFN-α1b和5-FU联合诱导肝癌细胞凋亡的敏感性。创新点及意义1.首次报道HCC下调miR-26a与HCC转移和复发呈负相关。2.首次发现miR-26a通过抑制IL-6-stat3信号通路抑制HCC的生长,侵袭和转移。3.首次发现miR-26a通过定向抑制HGF-cMet信号通路抑制肝癌血管生成。4.联合IFN-α1b和5-FU治疗性上调miR-26a部分通过线粒体凋亡途径诱导HCC细胞凋亡,同时miR-26a也增加了IFN-α1b和5-FU治疗诱导肝癌细胞凋亡的敏感性。潜在应用价值1.通过检测miR-26a的表达水平可预测HCC患者的预后2.通过上调miR-26a可望抑制IL-6-stat3信号通路和HGF-cMet信号通路,可一次性多靶点地抑制HCC生长、侵袭、转移和血管生成的关键通路；同时有望与分子靶向药物联合进一步提高抗HCC转移治疗效果,具有非常重要的临床应用前景。3.miR-26a参与调控IFN-α1b和5-FU联合干预诱导肝癌细胞的凋亡,为临床IFN-α1b和5-FU联合治疗抑制肝癌提供理论依据。
【作者】杨鑫；
【导师】钦伦秀；
【作者基本信息】复旦大学，外科学，2013，博士
【关键词】微小RNA-26a；肝细胞癌；预后；转移；白介素6；肝细胞生长因子；血管生成；干扰素-α1b；氟尿嘧啶；
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